N50 / read length

How to interpret read length distribution in Nanopore sequencing

Note

Public This page explains what N50 and read length mean, how to interpret them in practice, and why they should not be used as a single performance indicator.

Definition

Read length 指的是每一條 sequencing read 的長度（bp）。

N50 是一個用來描述 read length 分布的統計指標，定義為：

將所有 reads 依長度排序後，累積長度達到總量 50% 時所對應的 read 長度。

簡單來說：

  • N50 越大，代表 dataset 中有較多較長的 reads
  • N50 反映的是「長度分布」，不是單一 read 的品質

Why it matters

在 Nanopore sequencing 中，read length 是一個非常重要的特性，因為 long-read 的價值就在於：

  • 可以跨越重複區域
  • 可以提供較完整的結構資訊
  • 在某些分析（assembly、structural variation）中特別重要

N50 常被用來快速描述一個 dataset 的「長度表現」，例如：

  • library preparation 是否成功
  • DNA fragmentation 是否過度
  • 不同 run 之間的表現比較

但在不同應用情境中，read length 的重要性也不同：

  • pathogen detection：通常不需要極長 reads
  • genome assembly：通常會非常在意 read length
  • metagenomics：需要平衡 read length 與 read count

How to interpret

In practice

在 ONT workflow 中，read length 與 N50 的解讀應該放在「分析目的」的脈絡下。

常見實務觀察：

  • N50 高 → 通常代表 DNA 品質較好、fragmentation 較少
  • N50 低 → 可能代表 DNA degraded、或 library prep 過程中產生過多短片段

但要注意：

  • N50 是 distribution summary，不代表所有 reads 都很長
  • 少數極長 reads 可能會拉高平均值，但不一定改變整體結構

What to compare with

N50 不應單獨解讀，建議搭配以下資訊：

  • read count（總 reads 數）
  • total bases
  • read length distribution（直方圖）
  • median read length
  • Q score（品質）
  • mapping rate（是否真的有用）

例如：

  • 高 N50 + 低 read count → 可能長但不夠多
  • 低 N50 + 高 read count → 可能短但量足夠
  • N50 改善但 target detection 沒變 → 可能對該分析影響不大

Common pitfalls

Warning

N50 是一個很容易被誤用或過度解讀的指標。

  • 把 N50 當作「越高越好」的單一指標
  • 忽略 read length 分布，只看單一 summary statistic
  • 不同分析目的使用同一個 N50 標準
  • 把 N50 當成品質指標（它不是）
  • 在 read count 很低的情況下解讀 N50（統計不穩定）

Tools / commands

read length 與 N50 通常透過 QC 工具查看，而不是單獨計算。

Common tools

  • NanoPlot
  • pycoQC
  • seqkit stats
  • custom scripts（length distribution）

Example command

NanoPlot --fastq reads.fastq -o nanoplot_length

或使用 seqkit：

seqkit stats reads.fastq

Quick takeaway

Tip

N50 是描述 read length 分布的統計指標，不是品質指標。
在 Nanopore 分析中，read length 的重要性取決於分析目的；
比起追求單一高 N50，更重要的是同時考慮 read count、分布、品質與實際分析結果。