FASTQ QC

How to evaluate raw Nanopore sequencing reads before downstream analysis

Note

Public This page explains how to perform and interpret FASTQ-level quality control in Nanopore sequencing before downstream analysis.

Definition

FASTQ QC 指的是在 downstream analysis 之前，先對原始 reads 的基本品質與結構做初步檢查。

對 Nanopore 資料來說，FASTQ QC 通常回答以下問題：

  • 這批 reads 的整體品質如何？
  • read 數量與總 bases 是否足夠？
  • read length 分布是否合理？
  • 是否存在明顯異常，導致後續分析結果不可靠？

FASTQ QC 不是最終判讀，但它是進入後續分析前最重要的第一關。

Why it matters

在 Nanopore sequencing workflow 中，如果 FASTQ QC 沒先看清楚，就很容易出現以下問題：

  • downstream 結果很差，卻不知道是 sample 問題還是分析問題
  • 讀到少量目標訊號時，無法判斷是低 abundance 還是資料本身品質不足
  • 分析花很多時間，但最後發現 run 本身就不適合繼續解讀

FASTQ QC 的價值不在於追求「漂亮數字」，而在於判斷：

這批資料是否足以支撐接下來想做的分析

What to check

FASTQ QC 最常看的幾個核心面向如下。

1. Read count

read count 是最基本的資料量指標之一。

它回答的是：

  • 這批資料總共有多少條 reads？
  • 不同樣本之間 read 數量是否差太多？
  • 是否出現明顯低產出樣本？

實務上，read count 太低時，常會限制：

  • 病原偵測靈敏度
  • taxonomic classification 穩定性
  • alignment coverage

但 read count 多，不代表資料一定好，仍需搭配其他指標一起看。

2. Total bases

total bases 代表總共產生了多少鹼基數。

這個值比單純 read count 更能反映實際資料量，因為：

  • 有些 run reads 多，但都很短
  • 有些 run reads 較少，但總 bases 很高

在 Nanopore 中，total bases 通常和後續的資料利用率很有關係，特別是：

  • sequencing depth
  • assembly 潛力
  • target detection sensitivity

3. Read length distribution

Nanopore 的重要特性之一是 long reads，因此 read length 分布很值得看。

可以從這裡判斷：

  • 這批 DNA 是否過度 fragmented
  • library preparation 是否保留了足夠長的片段
  • 這批資料偏向短 reads 還是長 reads

這一項通常要搭配：

  • N50
  • mean read length
  • median read length
  • length histogram

一起看會比較有意義。

4. Quality score distribution

quality score（Q score）反映的是 basecalling 品質。

FASTQ QC 中，Q score 常被拿來做快速品質檢查，但不應單獨使用。

在實務上，Q score 的重點不是追求單一高值，而是看：

  • 整體分布是否合理
  • 是否有大量極低品質 reads
  • 不同樣本之間是否差異過大

5. Abnormal patterns

FASTQ QC 也要注意是否有一些「一眼就不對勁」的異常現象，例如：

  • read 數量異常低
  • read 長度過短
  • 品質分布明顯偏低
  • 樣本之間落差過大
  • 整批資料與預期完全不符

這些現象未必能直接告訴說明原因，但會提醒：

這批資料不能直接進入後續解讀，而是需要先釐清問題來源

How to interpret

這一段的重點不是單看某一個值，而是整體判斷資料是否「適合的分析目的」。

In practice

在 Nanopore workflow 中，FASTQ QC 的實務解讀通常是這樣：

  • 若目標是 初步 pathogen screening
    重點會放在：是否有足夠 usable reads、是否有合理 total bases、品質是否不至於太差

  • 若目標是 reference alignment / validation
    重點會放在：Q score、read length、後續 mapping potential

  • 若目標是 assembly / structural analysis
    重點會放在：read length distribution、N50、total bases

換句話說：

同一批 FASTQ，在不同分析目的下，QC 判斷標準不一定相同

What to compare with

FASTQ QC 最好至少一起比較這些資訊：

  • read count
  • total bases
  • Q score
  • read length / N50
  • NanoPlot 視覺化結果
  • sequencing depth（若已有 reference）
  • negative control 或其他樣本表現

如果只看其中一個值，很容易誤判。

例如：

  • read count 很高，但 reads 都很短
  • Q score 還可以，但 total bases 太少
  • N50 很漂亮，但 usable reads 不夠
  • total bases 很多，但大部分都是 host background

Common pitfalls

Warning

FASTQ QC 最常見的錯誤，不是數值看錯，而是解讀方式太單一。

  • 只看 Q score，不看 read length 與資料量
  • 只看 read count，不看 total bases
  • 只看 summary statistics，不看 distribution
  • 把「數值不漂亮」直接當成資料不能用
  • 把「數值漂亮」直接當成分析一定可靠
  • 不依分析目的調整 QC 觀點

Common tools

FASTQ QC 常用工具包括：

  • NanoPlot
  • NanoStat
  • seqkit
  • basecalling summary outputs
  • 自訂統計腳本

不同工具用途稍有不同：

  • NanoPlot：視覺化最完整
  • NanoStat：快速 summary
  • seqkit stats：快速查看序列基本統計

Example commands

NanoStat

NanoStat --fastq reads.fastq

NanoPlot

NanoPlot --fastq reads.fastq -o nanoplot_output

seqkit

seqkit stats reads.fastq

Practical QC mindset

FASTQ QC 可以把它想成三個層次：

Layer 1：資料有多少？

  • read count
  • total bases

Layer 2：資料長什麼樣？

  • read length
  • N50
  • distribution

Layer 3：資料能不能用？

  • Q score
  • abnormal patterns
  • downstream suitability

真正重要的，不是某一個數字，而是：

這批 reads 是否足以支撐接下來要分析問題

Quick takeaway

Tip

FASTQ QC 是 Nanopore downstream analysis 前的第一層品質檢查。
它不只是看 reads 多不多、Q 值高不高，而是整合 read count、total bases、read length、quality 與分析目的，判斷資料是否足夠可靠。