NanoPlot

Visualizing and interpreting Nanopore sequencing quality and read characteristics

Note

Public This page explains what NanoPlot shows, how to generate its reports, and how to interpret common QC patterns in Nanopore sequencing data.

Definition

NanoPlot 是 Nanopore 常用的 QC 視覺化工具，用來整理與呈現 reads 的基本特徵，例如：

  • read length
  • quality score
  • total yield
  • read count
  • length vs quality relationship
  • yield over time

它的價值不只是「把圖畫出來」，而是幫助快速判斷：

這批資料的整體表現如何，以及是否有明顯異常需要注意。

Why it matters

在 Nanopore workflow 中，單看 summary statistics 往往不夠。

例如：

  • 平均 read length 不錯，但其實大多數 reads 很短
  • Q score 看似正常，但有一群極低品質 reads
  • total yield 還可以，但 run 很早就衰退

這些情況若只看表格，常常不容易發現；
但用 NanoPlot 的圖形化結果，通常會一眼看出來。

因此，NanoPlot 特別適合做：

  • FASTQ QC 的視覺化補充
  • 不同 run 或樣本之間的快速比較
  • 問題排查（DNA 品質、library prep、flow cell 表現）

Installation

pip

pip install NanoPlot

conda

conda install -c bioconda nanoplot

Basic usage

FASTQ input

NanoPlot --fastq reads.fastq -o nanoplot_output

gzipped FASTQ input

NanoPlot --fastq reads.fastq.gz -o nanoplot_output

BAM input

NanoPlot --bam alignment.bam -o nanoplot_output

Multiple files

NanoPlot --fastq sample1.fastq sample2.fastq -o nanoplot_output

Typical output

NanoPlot 通常會產生：

  • HTML report
  • summary statistics
  • PNG / PDF figures

這些輸出很適合用來做：

  • QC 紀錄
  • run review
  • 報告附圖
  • 教學示例

What to interpret

NanoPlot 最有價值的地方，在於它能把多個 QC 指標視覺化。
下面是最常見、也最值得看的幾類圖。

1. Read length distribution

這類圖通常是 histogram 或 density plot，用來看整批 reads 的長度分布。

What it shows

  • reads 是偏短還是偏長
  • 分布是否集中
  • 是否存在長尾
  • 是否有異常的大量短片段

How to interpret

常見情況包括：

  • 長尾分布明顯
    這通常是 Nanopore 資料常見的正常現象，代表有一部分 reads 很長。

  • 整體偏短
    可能代表：

    • DNA 本身已 degraded
    • extraction 過程造成 fragmentation
    • library prep 保留長片段效果不佳

  • 雙峰或多峰分布
    可能代表：

    • 不同片段族群混在一起
    • 某些步驟造成特定長度偏多
    • 樣本來源較複雜

Practical note

這張圖應與：

  • N50
  • mean read length
  • median read length

一起解讀，而不是單看圖形印象。

2. Quality score distribution

這類圖用來看 reads 的 Q score 分布。

What it shows

  • 整體品質分布是否集中
  • 是否有大量低品質 reads
  • 不同 run / 樣本之間是否有明顯差異

How to interpret

常見情況包括：

  • 主要集中在中等 Q score 範圍
    這通常是可接受的常見情形。

  • 整體偏低
    可能與以下因素有關：

    • DNA 品質不佳
    • library prep 問題
    • flow cell 表現較差
    • basecalling 條件不同

  • 有明顯低品質尾端
    代表一部分 reads 品質很低，後續分析時可能需特別留意 filtering。

Practical note

Q score 不應單獨解讀。
即使 Q score 普通，只要：

  • read 數量足夠
  • target 可穩定檢出
  • alignment 表現合理

資料仍可能有分析價值。

3. Yield over time

這類圖顯示 run 過程中資料產出的累積情況或時間變化。

What it shows

  • sequencing 是否穩定產出
  • flow cell 是否很早就衰退
  • 產出是否在前段快速完成

How to interpret

常見情況包括：

  • 穩定上升後逐漸趨緩
    通常屬於合理現象。

  • 很早就 plateau
    可能代表：

    • flow cell 狀態不佳
    • loading 效率問題
    • library 濃度或品質不足

  • 整體 yield 很低
    需考慮：

    • sample input 不足
    • library prep 問題
    • pore 活性問題

Practical note

這張圖很適合拿來 review run quality，尤其是比較不同 run 的整體表現。

4. Read length vs quality

這通常是 scatter plot，用來看 read length 與 Q score 的關係。

What it shows

  • 長 reads 是否明顯品質較差
  • 是否存在特定區域的異常點群
  • length 與 quality 是否呈現明顯 trade-off

How to interpret

常見情況包括：

  • 長 reads 與短 reads 品質差異不大
    通常是較理想的情況。

  • 長 reads 普遍偏低品質
    可能代表：

    • library prep 對超長片段較不穩
    • sample DNA 長片段品質不佳

  • 有一群特別短且低品質 reads
    這類 reads 在後續分析中通常比較不具代表性，可能要留意是否需要 filtering。

Practical note

這張圖很適合幫助判斷：

問題是來自「整批資料」，還是只集中在某一類 reads。

Common QC patterns

下面這些是 NanoPlot 常見、也最值得注意的 pattern。

Pattern Possible interpretation
read 長度整體偏短 DNA fragmentation / degraded sample
Q score 整體偏低 sample quality、library prep、flow cell 或 basecalling 問題
yield 很低 input / loading / run performance 問題
yield 很早 plateau flow cell 活性或 loading 問題
長 reads 品質特別差 長片段穩定性不足
大量極短 reads sample fragmentation 或 library artifact

How to use NanoPlot in practice

NanoPlot 很適合放在這個流程位置：

  1. basecalling 完成
  2. FASTQ QC summary
  3. NanoPlot 視覺化
  4. 判斷是否進入 downstream analysis

也就是說，它不是取代 FASTQ QC summary，而是：

把 FASTQ QC 的關鍵訊息看得更直觀。

Suggested interpretation workflow

Step 1：先看總量

  • read count
  • total bases
  • yield

Step 2：再看結構

  • read length distribution
  • N50
  • mean / median read length

Step 3：再看品質

  • Q score distribution
  • length vs quality

Step 4：最後看 run pattern

  • yield over time
  • 是否有異常衰退或早期 plateau

Common pitfalls

Warning

NanoPlot 很容易被當成「只看圖漂不漂亮」，但真正重點是判斷資料是否適合後續分析。

  • 只看單一圖，不整合其他指標
  • 把漂亮的分布直接等同於可用資料
  • 忽略分析目的差異
  • 不把 NanoPlot 和 read count、Q score、N50 一起看
  • 看見異常圖型卻沒有回頭檢查 sample / library / run 情況

Practical commands

Standard FASTQ report

NanoPlot --fastq reads.fastq -o nanoplot_output

Save plots as PNG

NanoPlot --fastq reads.fastq -o nanoplot_output --plots hex dot

Compare BAM-based aligned reads

NanoPlot --bam aligned_reads.bam -o nanoplot_bam_output

Quick takeaway

Tip

NanoPlot 的核心價值不只是畫圖，而是幫助快速理解 reads 的長度、品質與產出模式。
在實務上，最有用的做法是把 NanoPlot 視為 FASTQ QC 的視覺化判讀工具，並和 Q score、N50、read count 與 downstream 目的一起整合解讀。