Interpretation framework

How to interpret Nanopore pathogen detection results

Note

Public This page provides a general framework for interpreting Nanopore sequencing results in pathogen detection, independent of specific experimental setups.

Overview

Nanopore sequencing 可以快速產生大量 reads，但：

detect ≠ true presence ≠ biological relevance

因此，結果判讀需要整合多個層面的證據，而不是依賴單一指標。

Core principle

Nanopore pathogen detection interpretation 應基於三個核心面向：

  1. Signal strength（訊號強度）
  2. Specificity（特異性）
  3. Context（生物與實驗脈絡）

👉 三者缺一不可

1️⃣ Signal strength

評估「訊號是否足夠支持存在」

常用指標：

  • read count（reads 數）
  • total bases
  • relative abundance
  • depth（如果有 reference）

Interpretation concept

  • 高 read count → 較可信
  • 極低 read count → 需謹慎（可能 background）
Warning

低 read count 的 detection 不應直接解讀為陽性。

2️⃣ Specificity

評估「訊號是否真的來自目標」

需要確認：

  • alignment quality（minimap2）
  • coverage pattern（是否均勻）
  • 是否為 conserved region（可能 cross-match）
  • database bias（Kraken2）

常見問題

  • 近緣物種誤判
  • conserved gene（如 rRNA）造成假陽性
  • k-mer overlap

👉 因此：

Kraken2 結果應由 alignment 驗證

3️⃣ Context

這是最重要、也最常被忽略的一層

需要考慮：

  • sample type（environment / tissue / culture）
  • expected microbiome
  • known contamination sources
  • negative control
  • experimental design

Example

  • 在 environmental sample 中偵測到低量 bacteria → 可能正常
  • 在 sterile tissue 中偵測到同樣 bacteria → 可能重要

Integration logic

實務上應整合三個面向：

Signal Specificity Context Interpretation
High High Consistent Strong evidence
Low High Consistent Possible presence
Low Low Inconsistent Likely noise
High Low Inconsistent Suspect artifact

Minimal interpretation workflow

flowchart TD
    A[Kraken2 detection] --> B[minimap2 validation]
    B --> C{Good alignment?}

    C -->|No| D[Likely false positive]
    C -->|Yes| E[Check read count]

    E --> F{Sufficient signal?}
    F -->|No| G[Low confidence]
    F -->|Yes| H[Check context]

    H --> I{Biologically plausible?}
    I -->|No| J[Possible contamination]
    I -->|Yes| K[Supported detection]

Common pitfalls

Warning

錯誤判讀通常來自「單一指標導向」。

  • 只看 Kraken2
  • 只看 read count
  • 不做 alignment
  • 忽略 negative control
  • 忽略 sample context

Practical guidelines（general）

以下為通用建議（非固定標準）：

  • 不依賴單一 read 作為證據
  • 優先確認 alignment quality
  • 檢查 coverage 是否合理
  • 與 negative control 比較
  • 將結果放入 biological context 解讀

What this framework does NOT define

Note

This framework does not define strict thresholds.

以下項目需依不同實驗設定調整：

  • read count threshold
  • coverage cutoff
  • abundance cutoff
  • clinical significance criteria

👉 這些通常屬於：

  • specific project
  • clinical validation
  • regulatory setting

Quick takeaway

Tip

Nanopore 結果判讀不是單一數值判斷，而是多層證據整合。
Signal、specificity 與 context 必須同時考量，才能避免 false positive 或 over-interpretation。