Nanopore analysis workflow

End-to-end pipeline for pathogen detection and interpretation

Note

Public This page provides a complete end-to-end Nanopore analysis workflow, from raw data to biological interpretation.

Overview

Nanopore sequencing 的分析流程可以拆成四個核心層級：

  1. Data quality（資料品質）
  2. Composition（樣本組成）
  3. Validation（結果驗證）
  4. Interpretation（生物意義）

👉 每一層回答不同問題，缺一不可

Full workflow

flowchart TD
    A[Raw signal / FAST5] --> B[Basecalling]
    B --> C[FASTQ reads]

    C --> D[QC: Q score / read length]
    D --> E{QC pass?}

    E -->|No| F[Re-extract / clean-up / re-sequence]
    E -->|Yes| G[Kraken2 classification]

    G --> H{Candidate pathogen?}

    H -->|No| I[Check database / contamination / depth]
    H -->|Yes| J[minimap2 alignment]

    J --> K[Coverage / depth / mapping quality]

    K --> L{Sufficient evidence?}

    L -->|No| M[Increase depth / refine reference]
    L -->|Yes| N[Biological interpretation]

    N --> O[Report / decision making]

Step-by-step explanation

1️⃣ Basecalling

  • 將 raw signal（FAST5）轉成 FASTQ
  • 工具：Guppy / Dorado

👉 這一步決定後續所有分析品質

2️⃣ QC（Quality control）

對 FASTQ 做基本評估：

  • Q score（品質）
  • Read length / N50
  • Total bases
  • Read count

👉 對應頁面：

3️⃣ Classification（Kraken2）

目的：

找出樣本中「可能存在的生物」

特點：

  • 快速
  • 高通量
  • 適合初步篩檢

👉 對應頁面：

4️⃣ Alignment（minimap2）

目的：

驗證特定目標是否存在

評估指標：

  • coverage
  • depth
  • mapping quality
  • read consistency

👉 對應頁面：

5️⃣ Interpretation

這一步最關鍵，也是最容易被忽略：

需要整合：

  • read count
  • coverage
  • negative control
  • biological plausibility
  • sample context

👉 這一步沒有單一工具可以取代

Key decision points

QC 不佳

👉 問題可能在：

  • DNA degradation
  • extraction method
  • library prep
  • contamination

👉 不建議直接往下分析

Kraken2 有 hits

👉 不代表一定存在！

需要：

  • minimap2 驗證
  • 看 coverage（不是只看 read 數）

minimap2 有 alignment

👉 要確認：

  • 是否為特異性 mapping
  • 是否有均勻 coverage
  • 是否可能為 contamination

Minimal working pipeline（實務版）

# 1. QC
NanoPlot --fastq reads.fastq -o qc_report

# 2. classification
kraken2 --db kraken_db reads.fastq --report report.txt > output.txt

# 3. alignment
minimap2 -ax map-ont ref.fa reads.fastq > aln.sam

Common pitfalls

Warning

Nanopore workflow 最常見錯誤來自「過度簡化分析流程」。

  • 只做 Kraken2 就下結論
  • 忽略 QC
  • 不看 coverage
  • 不設 negative control
  • 過度解讀低 read count

Best practice summary

Tip

一個可靠的 Nanopore 分析流程應該同時具備：

  • QC（確保資料可信）
  • Classification（找方向）
  • Alignment（確認證據）
  • Interpretation（整合判讀）

Suggested figures（極需）

🖼️ Figure 1（已經有了）

👉 Mermaid workflow（上面那張）

🖼️ Figure 2（未來可以加）

👉 真實案例：

  • Kraken2 barplot
  • minimap2 coverage plot

👉 提升網站變「教學等級」