Common contamination sources

Understanding and controlling contamination in Nanopore sequencing

Note

Public This page summarizes common contamination sources in sequencing workflows and provides general strategies for identification and mitigation.

Overview

在 Nanopore 或任何 NGS 分析中：

contamination is not an exception — it is expected

因此：

  • 偵測到某個 organism ≠ 真正存在
  • 需要系統性判斷 contamination vs true signal

Major contamination sources

1️⃣ Reagent contamination

來源：

  • DNA extraction kits
  • enzymes / buffers
  • water（即使是 nuclease-free）

常見特徵：

  • 低 read count
  • 在不同樣本中反覆出現
  • 出現在 negative control

👉 常見稱為：

“kitome contamination”

2️⃣ Environmental contamination

來源：

  • 空氣（airborne microbes）
  • 操作台 / pipette
  • 操作者（skin microbiome）

特徵：

  • lab-specific pattern
  • batch-dependent
  • 與 sample type 無關

3️⃣ Cross-sample contamination

來源：

  • library prep 過程
  • barcode misassignment
  • carry-over

特徵：

  • 出現在同一批次其他樣本
  • read pattern 類似高 abundance sample

4️⃣ Host-derived sequences

來源：

  • 未完全去除的 host DNA
  • reference misclassification

特徵：

  • 大量 reads
  • alignment 到 host genome
  • Kraken2 可能誤分類

How to identify contamination

1️⃣ Use negative controls

👉 最重要的策略

觀察：

  • 是否出現在 control
  • abundance 是否相近

2️⃣ Check reproducibility

  • 是否在多個樣本中出現？
  • 是否跨 batch？

👉 高一致性但低量 → 常見 contamination

3️⃣ Compare abundance

  • true pathogen → 通常有較高 signal
  • contamination → 通常低且分散

4️⃣ Evaluate alignment

使用 minimap2：

  • 是否有良好 coverage？
  • 是否為局部 alignment？
  • 是否集中在 conserved region？

5️⃣ Consider biological plausibility

👉 關鍵問題：

  • 這個 organism 在這個 sample 合理嗎？
  • 是否符合已知 biology？

Practical workflow

flowchart TD
    A[Detection] --> B{In negative control?}
    B -->|Yes| C[Likely contamination]
    B -->|No| D[Check abundance]

    D --> E{Low signal?}
    E -->|Yes| F[Possible contamination]
    E -->|No| G[Check alignment]

    G --> H{Good coverage?}
    H -->|No| I[Suspect artifact]
    H -->|Yes| J[Check context]

    J --> K{Biologically plausible?}
    K -->|No| L[Uncertain]
    K -->|Yes| M[Supported detection]

Common contamination patterns

Pattern 1：Low-level ubiquitous bacteria

  • 多樣本出現
  • read count 低
  • control 中也存在

👉 通常為 reagent / environmental contamination

Pattern 2：Single-read detection

  • 只有 1–2 reads
  • 無 alignment support

👉 不應解讀為陽性

Pattern 3：Unexpected organism

  • 與 sample biology 不符
  • 無其他 supporting evidence

👉 高度懷疑 contamination

Pattern 4：Batch-specific signal

  • 同一批次樣本出現
  • 不同批次消失

👉 可能為 batch contamination

Mitigation strategies

Laboratory level

  • 使用 clean workspace
  • 分區操作（pre-PCR / post-PCR）
  • 使用 filter tips
  • 定期清潔設備

Experimental design

  • 加入 negative controls
  • 使用 technical replicates
  • 避免過度 multiplexing

Bioinformatics level

  • host depletion
  • filtering low-abundance reads
  • cross-sample comparison
  • database curation

Key principle

Tip

Contamination cannot be completely eliminated, but it can be recognized and managed.

What NOT to do

Warning

以下做法容易導致錯誤結論：

  • 將所有 detection 視為真實存在
  • 忽略 negative control
  • 不做 alignment validation
  • 過度解讀低 read count
  • 不考慮 sample context

Quick takeaway

Tip

在 Nanopore 分析中，contamination 是常態而非例外。
可靠的結果來自於：control、alignment、abundance 與 biological context 的整合判讀。